瓊脂糖膠和PAGE膠制備方法

一、瓊脂糖凝膠的特點
天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80％）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下。
（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。
（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98％~99％），近似自由電泳，樣品擴散較自由電流，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。
（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。
目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合，發(fā)展成免疫電泳技術(shù)，能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系，由于建立了超微量技術(shù)，0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設(shè)備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。

二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：供價閉環(huán)DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時，環(huán)狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構(gòu)型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板wan全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易于制作，又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩沖液系統(tǒng)
缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩沖液由于電流太大會大量產(chǎn)熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼/酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低，后兩者有足夠高的緩沖能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現(xiàn)沉淀，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
（3）凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖液為溶劑，用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配制與加樣
DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25％溴酚藍或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結(jié)果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳分辨率反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強度不宜高于5V/cm。
電泳系統(tǒng)的溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5％時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

SDS-PAGE膠制備

一. 實驗原理：
SDS-PAGE是對蛋白質(zhì)進行量化，比較及特性鑒定的一種經(jīng)濟、快速、而且可重復(fù)的方法。該法是依據(jù)混合蛋白的分子量不同來進行分離的。
SDS是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其廣泛存在于一個廣泛均一的溶液中。SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。在樣品介質(zhì)和凝膠中加入強還原劑和去污劑后，電荷因素可被忽略。蛋白亞基的遷移率取決于亞基分子量。
二. 試劑和器材：
試劑：1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1％溴酚藍，0.9ml蒸餾水?？稍?℃保存數(shù)周，或在－20℃保存數(shù)月。
2. 凝膠貯液：在通風(fēng)櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙2胺）原液
6.10％過硫/酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調(diào)pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。
8. 考馬斯亮藍G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過/氯酸，最后補足水到250ml，攪拌1小時，小孔濾紙過濾。
器材：電泳儀，電泳槽，水浴鍋，搖床。

三. 實驗操作；
（一）樣品制備
將蛋白質(zhì)樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min，取上清點樣。
（二）分離膠及濃縮膠的制備1 將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板；
3 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml，混勻；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合；
5 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml，混勻；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳；
7 裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣20 μl;
8 穩(wěn)壓200V，溴酚藍剛跑出分離膠時，停止電泳，約需45 min～1hr.
9 卸下膠板，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr；加入脫色液，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸餾水）至wan全脫凈。