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產(chǎn)品分類ELISA實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用什么樣的酶來標(biāo)記抗原或者抗體呢?
對此問題,我公司技術(shù)回復(fù)解釋。在ELISA中,用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物,此為進(jìn)行ELISA檢測的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地制備酶結(jié)合物,而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定,具有很高的酶活性,抗原或抗體的特異性,產(chǎn)量高及成本低。
那么用什么樣的酶來標(biāo)記抗原或抗體呢?
1.酶制品的純度及活力高,催化效力也高,放大倍數(shù)大(即一個(gè)酶分子能催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)的酶)。
2.酶及制備好的酶結(jié)合物在檢測或貯存中能保持穩(wěn)定。
3.酶制劑易得、價(jià)廉.
4.既要適用于標(biāo)記抗原,又適用于標(biāo)記抗體,標(biāo)記后不影響抗原或抗體的免疫學(xué)特性,也不降低酶的活性。
5.酶的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定,檢測時(shí)簡便、快速。在定量測定中產(chǎn)物必須是可溶性的。
6.要有安全、價(jià)廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有:堿性磷酸酶,一般用分子量為5×105(Alkaline Phospatase,簡稱AP),辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104),另外尚有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖甙酶,糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種(AP和HRP)zui為常用。
AP活力高,制備好的酶結(jié)合物可加NaN3防腐,但此種酶不易獲得,因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取,而且價(jià)格比較昂貴。因此,目前國內(nèi)外大多使用HRP。HRP活性也高,價(jià)格較便宜。但制得酶結(jié)合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性,但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝,保存冰箱,一般可用1-2年。
結(jié)合:用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結(jié)合起來呢?當(dāng)然不能用強(qiáng)烈的方法,因?yàn)閺?qiáng)烈的方法會(huì)使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結(jié)合起來。因此,必須使用結(jié)合劑。理想的結(jié)合劑應(yīng)具備下列條件:
1.不影響酶及抗體活性;
2.不產(chǎn)生干擾物質(zhì);
3.抗體和酶結(jié)合后應(yīng)有較高的產(chǎn)量;
4.不出現(xiàn)非特異性反應(yīng);
5.結(jié)合程序簡便;
6.來源易、價(jià)廉。
目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由于對所使用結(jié)合劑的針對性,因此標(biāo)記的方法也有戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鈉氧化法兩類。
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