細(xì)胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒

YIJI細(xì)胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI細(xì)胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)人工合成多肽底物，在CDK6/CYCLIN D激酶抑制劑的存在下，受到CDK4/CYCLIN D磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中CDK4/CYCLIN D特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中CDK4/CYCLIN D激酶的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

細(xì)胞周期素依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4；CDK4；EC 2.7.11.22），又稱為皮膚惡性黑色素瘤因子3（cutaneous malignant melanoma 3；CMM3），屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其與酵母細(xì)胞的cdc28和cdc2高度進(jìn)化保留。細(xì)胞周期素依賴性激酶4的催化亞體，在細(xì)胞周期素D和p16的調(diào)節(jié)下，在細(xì)胞周期G1-S期作用，允許細(xì)胞通過(guò)G1期，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等。P16INK4a 是CDK4激酶的抑制劑。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤（retinoblastoma；Rb）基因產(chǎn)物是CDK4激酶的磷酸化目標(biāo)蛋白。細(xì)胞周期素依賴性激酶4異常將導(dǎo)致惡性腫瘤等。CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化目標(biāo)序列為RPPTLSPIPHIPR。基于底物RPPTLSPIPHIPR，在ATP和CDK6/CYCLIN D抑制劑Ro 318220的存在下，受到CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析細(xì)胞周期素依賴性激酶4/細(xì)胞周期素D的特異活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）   毫升

YIJI裂解液（Reagent B）   毫升

YIJI緩沖液（Reagent C）  毫升

YIJI酶促液（Reagent D）  微升

YIJI反應(yīng)液（Reagent E）  微升

YIJI底物液（Reagent F）   微升

YIJI陰性液（Reagent G）  微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

CDK4/CYCLIN D激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 待測(cè)樣品準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 106細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 測(cè)定準(zhǔn)備
• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 背景對(duì)照測(cè)定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
• 樣品測(cè)定
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘
• 計(jì)算樣品活性
• 酶標(biāo)板測(cè)定
• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

七、抑制劑篩選

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘
• 抑制活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液 
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
• 光譜測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1） 
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用CDK4/CYCLIN D抑制劑二氨基氧吖啶氫硫酮【1,4-Dimethoxyacridine-9(10H)-thione）；IC50＝200納摩爾】或Arcyriaflavin A（IC50=59納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• CDK4/CYCLIN D激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感