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產(chǎn)品分類YIJI組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)
主要用途
YIJI組織IKKβ激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過人工合成多肽底物,在IKKβ激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下,受到IKKβ磷酸化后,進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng),測定產(chǎn)生ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應(yīng), 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化,以分析組織裂解樣品中IKKβ特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品(動物、人體)、部分或*純化酶樣品中IKKβ激酶的定量檢測,以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定,高度敏感。
技術(shù)背景
B細(xì)胞κ輕鏈多肽基因促動子抑制劑激酶復(fù)合物(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells,kinase complex;IκB kinase;IKK;EC 2.7.11.10),是NF-κB信號通路中的成員之一,由3個(gè)亞體構(gòu)成:IKKα,又稱為IKK1或CHUK(conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase);IKKβ,又稱為IKK2或IKBKB;IKKγ,又稱為NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4,屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家屬中鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體激酶(guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase;GRK)亞系成員之一。多基因GRK亞系由6個(gè)成員構(gòu)成,分成3類:包括GRK1(視網(wǎng)膜色素激酶家系;rhodopsin kinase)、GRK2/3(β腎上腺素能受體激酶;β-adrenergic receptor kinase)以及IKK/5/6(IKK激酶)。其中G蛋白偶聯(lián)受體激酶4至少有4種變異體:IKKα、β、γ、δ,在睪丸組織中高度表達(dá)。IKK使G蛋白偶聯(lián)受體,例如多巴胺等去敏化(desensitization)、以及精子授精等有關(guān)。其目標(biāo)蛋白為活化的G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白,進(jìn)行磷酸化后,抑制其功能。其功能異常將導(dǎo)致遺傳性或獲得性高血壓等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA,在IKKβ激酶敏感性抑制劑5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺((5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide)存在與否的情況下,受到IKKβ激酶的磷酸化,獲得產(chǎn)物磷酸化多肽,進(jìn)而通過丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase;LDH)反應(yīng)系統(tǒng)中,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的變化(340nm),來定量分析IKKβ的特異活性。其反應(yīng)方式為:
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液(Reagent A) 毫升
YIJI裂解液(Reagent B) 毫升
YIJI緩沖液(Reagent C) 毫升
YIJI酶促液(Reagent D) 微升
YIJI反應(yīng)液(Reagent E) 微升
YIJI底物液(Reagent F) 微升
YIJI陰性液(Reagent G) 微升
YIJI專性液(Reagent H) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月
用戶自備
IKKβ激酶:用于抑制劑篩選
1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品處理的容器
(微型)臺式離心機(jī):用于組織預(yù)處理
比色皿或酶標(biāo)板:用于光譜分析操作的容器
分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于樣品光譜分析
實(shí)驗(yàn)步驟
檢測開始前,移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C)到1.5毫升離心管,分別加入xx微升YIJI專性液(Reagent H)和待測樣品(注意:50微克組織裂解蛋白),混勻后,放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。
2)樣品特異活性計(jì)算
七、酶標(biāo)板測定
1)樣品總活性測定
檢測開始前,移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C)到1.5毫升離心管,分別加入xx微升YIJI專性液(Reagent H)和待測樣品(注意:50微克組織裂解蛋白),混勻后,放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。
八、抑制劑篩選
內(nèi)容物 | 空背景對照 | 樣本背景 | *酶活性 | 待測抑制劑酶活性 |
YIJI緩沖液(Reagent C) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
YIJI陰性液(Reagent G) | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
待測抑制劑 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
用戶自備的純化酶 | —— | —— | xx微升(1毫單位) | xx微升(1毫單位) |
96孔板每孔總量 | 空背景對照孔 (xx微升) | 樣本背景孔 (xx微升) | *活性孔 (xx微升) | 待測抑制劑樣品孔 (xx微升) |
輕輕搖動酶標(biāo)板,混勻,放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作 |
注意事項(xiàng)
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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