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免疫組化實(shí)驗(yàn)的要點(diǎn)和技巧

更新時(shí)間:2011-07-15      瀏覽次數(shù):1974

上海一基實(shí)業(yè)有限公司主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Sigma、America 、等多個(gè)國外。
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1.固定:用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好;但對(duì)于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液。有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液,請(qǐng)于購置前注意說明書。

Bouin S固定液:飽和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的長期保存。

PLP液:即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

2.組織脫水,透明:時(shí)間不能太長,否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整。

3.切片時(shí)展片:有些組織在切片后難以在水中展開,這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?

4.烤片:60 30分鐘或37 過夜,溫度太高或時(shí)間太長,抗原容易丟失。

5.蠟塊及切片的保存:在4保存

6.脫片問題: Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,可用雙重處理(APESPoly-L-Lysine)的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切片在脫蠟前,放在APES 150 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步。

7.滅活內(nèi)源性酶:HRP系統(tǒng):3%雙氧水滅活;AP系統(tǒng):3%HAc滅活。

8.暴露抗原:對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的*修復(fù)液參閱抗體說明書)。對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9.封閉:在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉

10.抗體稀釋:應(yīng)遵循現(xiàn)用現(xiàn)配的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11.背景高:在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20PBS洗,特別是在顯色之前要多洗。

12.返藍(lán):在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液(如PBS)或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。

13.顯色:一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景。

14.在整個(gè)操作過程中,切片千萬不能干燥,否則會(huì)有非特異性染色。

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